光谱流式与传统流式的“同”与“异”

在本文中，讨论传统（基于补偿）流式细胞术和光谱（基于光谱解析）流式细胞术的亮点、相同点和不同点。

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流式细胞术是一种强大的研究工具，普遍用于细胞鉴定和表征，以及建立感兴趣蛋白质的表达分析。运用光谱流式细胞术的实验和方案设计的原理与传统的流式细胞术相同（图1）。每个实验应可解决一个基于清晰、可验证假设的问题。确定生物学问题并建立适当的实验设计对于生成准确、可重复的数据至关重要 [1]。

图1.流式细胞术实验过程概图。  

确定生物学问题后，应确定应对此假设所需的细胞或组织类型。系统的生物学将决定所需的生物标志物和使用的指标，例如是否存在细胞群体、相对群体百分比、细胞计数或荧光强度。通常，这可通过对文献的全面审查而实现。审查应侧重与感兴趣的生物系统、细胞或蛋白质性质相似的同行评议研究。从而找到实验设计和执行实验的关键考虑因素，以及制备流式细胞采集样品的挑战。光谱流式细胞术结合了对多个标记物的评估，可提供更加准确全面的评估结果，使其成为全面了解免疫细胞和疾病动力学之间各种相互作用的有效工具。

在设计实验的早期阶段，有必要咨询统计学家或生物信息学专家协助进行实验设计、样品量确定，以及探讨数据分析策略，以支持研究问题。在计划阶段，还有必要考虑发表结果所需的信息。出版物 MiFlowCyt 需求检查表与流式细胞术实验相关，确保适度提供了基本的实验信息 [2]。

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使用流式细胞术需制备样品并处理成单细胞悬浮液进行检测。大部分样品需要进行某种程度的处理，以制备抗体标记。样品处理的主要目的是获得活的单细胞悬浮液以进行标记。样品制备过程中可能产生的问题包括细胞聚集（细胞成团）、细胞死亡、细胞活化以及表位变化或蛋白质丢失（脱落、内化）。必须注意，样品的质量决定所生成数据的质量。

应彻底优化和规范样品制备，特别是培养时间、温度、试剂/缓冲液的选择和样品处理时间。样品处理温度应与生物系统和使用的试剂/缓冲液保持一致。总之，处理方法应是微创的，仅用于制备样品进行标记。样品处理后，建议进行视觉检查，以确定样品的质量，且有必要确定细胞计数或细胞浓度，对细胞进行定量分析，以进行后续的抗体染色和流式细胞术评估。具体的细胞处理方法可视细胞的培养方式而定。有关非贴壁/贴壁细胞和组织的考虑因素如下：

在实验过程中，任何类型的细胞或组织都可能需要分离、扩增和冷冻保存。使用这些方法时需要考虑的一些因素如下：

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初始实验计划包括鉴定感兴趣抗原，并将其分类为表面表达或细胞内表达。研究人员可以查阅之前发表的文献，以了解可鉴定感兴趣群体的抗原组合。其中，值得关注的资源是高级多色免疫荧光配色方案 (OMIP)，这是《细胞计数 A》杂志中的一种文献类型，具有优化的多参数方案，用于传统流式细胞术和光谱流式细胞术，以帮助其他研究人员开发多色方案 [8]。《细胞计数 A》中的另一个有用工具是微型综述，称为“表型报告”，旨在帮助研究人员鉴定不同细胞类型 [9]。

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抗体研究的目标是为特异性靶标和应用选择合适的试剂。抗体代表基础科学研究中的关键工具，免疫分型应用于许多平台，包括流式细胞术。可对三种抗体进行定义。

为了提高流式细胞术实验的重现性，通常建议使用单克隆抗体或重组抗体。近期的出版物指出，抗体验证缺少通用标准，这表示有产生假阴性结果、假阳性结果或不一致结果的可能性 [10–11]。抗体验证的国际工作组 (IWGAV) 已经针对改进抗体使用标准提出了指导意见，为抗体验证以特定应用方式的使用提供了框架 [12]。为确保抗体在流式细胞术实验中提供有效实验结果，抗体必须具有特异性、选择性、敏感性，并在优化的稀释度下提供可重现结果 [13]。研究人员利用抗体验证的原理知识，依据制造商和开发人员提供的数据选择抗体试剂，并从可靠供应商处采购抗体试剂 [14]。检测每个抗体的靶标特异性和功能应用性可确保抗体与正确的靶标结合，并在使用的特定应用中发挥作用。在抗体供应商提供验证信息后，由最终用户负责在其环境中验证抗体性能 [15]。

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了解抗原表达模式和抗原密度水平对开发稳健方案至关重要，以确保不同细胞亚群的最大分辨率。抗原的相对密度与其在细胞上或细胞内的数量直接相关，在流式细胞术中通常被描述为中、低和高密度。一些抗原的特征明显，而其他抗原的结构和功能仍未知。已汇编部分细胞表面蛋白质表达水平的资源以提供有用的信息 [16–18]。这些特性使得抗原能够进行分层分类，有助于流式细胞术方案设计 [19]。在已知感兴趣的抗原后，概述初步的门控策略有助于定义抗原之间的关系、表达模式以及可提高分辨率的位置（图2）。

A.

B.

C.

图2.门控策略。在选择鉴定感兴趣细胞的靶标群体和标记物后，必须创建门控策略。门控策略可以简单地绘制 (A)，或使用谱系树 (B)，或按照发表的方案 (C) 执行。在将标记物与荧光团配对时，了解共同表达的标记物以及具有互斥表达的标记物，这一点至关重要。  

研究人员应注意分析所需的细胞群体，定义鉴定感兴趣细胞所需的谱系标记物，并突出共同表达的标记物（图3）。在本阶段，可以评估抗原及其特征。抗原类型和每种抗原的特征如下所示：

图3.确定共表达。扩散问题会影响细胞共同表达两种或更多抗原的情况。确定共同表达的靶标，并选择相似度低的荧光团。对于具有互斥表达的靶标，保留使用相似性较高的荧光团。  

在特异性检测、靶标定位和对不同处理方法的敏感性方面，应考虑确定合适的抗体克隆。供应商的抗体数据表是重要的信息来源，包含抗体克隆和亚型、物种反应性、表位、测试应用、方案、建议使用的抗体浓度、荧光团偶联物和样本数据。这里是抗体数据表的示例。此外，网络平台可提供有关靶标的有价值的对比信息，以及相关出版物的链接 [20–21]。

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使用的流式细胞仪配置和功能或使用的分选仪器将确定方案的开发。如要确定可有效检测到那些荧光团，需验证仪器的光学配置。这包括检查可用的激光器、激光器波长和功率、激光器是共线的还是空间分离的、光路、以及捕获生成的发射量的光电检测器的数量和类型 [3]。在光谱流式细胞术中，荧光信号来自所有可用激光器和检测器，为给定荧光团生成更加详细的光谱特征（图4）。

图4.APC 的光谱特征，一次和五次激光激发比较。(A) 单次激光激发下荧光团 APC 的归一化发射光谱特征（正如在传统流式细胞仪上看到的）。(B) 五次激光激发下 APC 的归一化发射光谱特征（通过光谱流式细胞术可见)。额外激光激发获得的二次发射量提供了光谱特征的详细信息。  

这些附加信息有助于区分具有几乎相同的峰值发射量但不同的非高峰发射量的荧光团。例如，别藻蓝蛋白 (APC) 和 Alexa Fluor 647 染料光谱特征的对比只显示了二者在单频红光激光器激发下发射量的细微差异（图5）。但是，当不仅从红光激光器，也从其他激光器（包括紫外、紫光、蓝光和黄光/绿光激光器）中收集发射信号时，会出现 APC 和 Alexa Fluor 647 染料的独特特征，允许在光谱流式细胞仪方案中联合使用（图5）。一些仪器自带优选的仪器设置，通常称为检测设置。这些优化的检测器设置用于在保持荧光团的光谱独特性的同时，于不同检测器阵列检测范围内的最佳信号分辨率取得平衡。制造商开发的仪器设置适用于大多数情况，但在某些情况下，需要对这些仪器进行优化，以提高检测效率或防止信号饱和。

图5.高度重叠荧光团的光谱特征比较。APC（斜线）和 Alexa Fluor 647 荧光团（灰色）的归一化光谱特征重叠显示了两个荧光团之间的差异。

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在确定仪器的配置后，下一步是在特异细胞仪上对染料进行表征。首先运行多个荧光团，以在细胞仪上对染料进行表征，查看细胞仪输出的情况。通常运行每个可用荧光团的 CD4 偶联物（或另一个已知靶标），检查光谱特征，以确定兼容项。兼容性将包括找出哪些荧光团重叠或光谱特征中的哪些区域可以用来寻找其他的荧光团来扩大面板

因此，可查看仪器上的或网络中的光谱查看器。这些工具通常通过绘制归一化强度与波长的关系图，显示荧光团的激发和发射光谱。一些光谱查看器提供特定仪器的配置，显示兼容性荧光团的光谱特征。由于仪器配置和检测器灵敏度的差异以及荧光团的变化，所以光谱查看器所示数据和特定仪器所获数据的光谱特征可能略有不同。使用依您仪器配置而设定的光谱查看器和配色工具是较理想的。光谱查看器和配色工具可以叠加荧光团光谱，计算出荧光团之间的相似性指数。有关相似性指数的示例，请参见流式配色方案页面。

相似性指数是一种比较特征，从独特性到相同性程度上，定量评估了两个荧光团的发射曲线重叠情况。如果指数接近0，则表示两个荧光团的光谱特征极为不同，比较中的两个荧光团之间重叠量极低。如果指数接近100，则表示两个荧光团的光谱特征彼此相似。建议避免使用相似性指数大于98的荧光团，以限制数据过度扩散，并可降低无法分离信号的风险。90–98的高相似性指数可能与高度扩散相关，应谨慎使用，特别是抗原处于共同表达的情况下。在为共同表达的抗原选择荧光团时，建议避免选择相似性指数大于70的荧光团。如要了解有关荧光的更多信息，请参见 Molecular Probes 荧光大课堂—荧光基础知识。

评估试剂是的另一个重要考虑因素是与抗体偶联的可用荧光团的相对亮度（图6）。

图6.染色指数测量相对荧光团亮度。采用与5个不同荧光团偶联的抗人 CD4 抗体标记新分离的 PBMC。利用 5-激光 Aurora 光谱细胞仪通过淋巴细胞门采集数据。未染色（蓝色）和染色淋巴细胞（紫色）的直方叠加图从左到右显示亮度和染色指数不断增加。  

在特定仪器配置的相同条件下，使用相同抗体的不同荧光偶联物对细胞进行染色，以计算染色指数或分离指数，从而评价荧光团并对其相对亮度进行排序。通常情况下，使用 CD4 抗体，因为该抗体具有定义明确的阳性和阴性群体，且可用于与大多数市售荧光团直接偶联（图7） [4–6]。

图7.相对染色指数。使用与各种荧光团偶联的抗人 CD4 抗体标记新分离的 PBMC，使用 5-激光 Aurora 光谱细胞仪通过淋巴细胞门采集数据。计算每个荧光团的染色指数，并使用染色指数对所有荧光团的相对染色指数从暗到亮进行排序。 下载荧光染料亮度染色指数 PDF，查看所有可用的荧光团。

由于可用荧光团的数量不断增长，所以必须了解关键荧光团特征。在方案设计中，将抗体与荧光团配对时使用相对亮度信息。总之，建议将明亮的荧光团与低密度抗原配对，昏暗的荧光团与高密度抗原配对。另一个考虑因素是荧光团光谱的独特性，光谱越独特，扩散越小。有关扩散的详细说明，请参见光谱流式细胞术配色方案页面。

开发具有独特光谱和最小交叉激光激发的新型荧光团是光谱流式细胞术的理想选择，因为这些荧光团设计用于减少光谱溢漏和扩散，从而保持数据分辨率。如果可能，光谱方案设计过程的第一步应为获得未染色样品的自发荧光特征，这有助于直观地看到在选择荧光团时应避免或支持的光谱区域，从而保持数据分辨率。

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在常规流式细胞术中，“溢漏”指一个荧光团的发射溢漏到分配给另一个荧光团的检测器。使用补偿时，可纠正溢漏现象。在光谱流式细胞术中，溢漏的更准确描述是光谱重叠，数据在多个检测器之间解析，以分离每个荧光团的独特光谱特征。扩散是指光子计数误差，由于检测器的不准确性，导致荧光强度的扩散。在进行补偿或光谱分离后，可见到扩散，导致在接收溢漏的检测器中看到阳性群体的扩展或扩散（图8） [7]。在方案中最好只使用具有独特光谱特征而没有重叠发射的荧光团。但是，在了解会发生扩散的情况下，方案中也可使用具有相似光谱特征的荧光团。采取措施尽量减少扩散的影响可能是必要的。

图8.分离后出现扩散。使用 CD4-PE 单独标记淋巴细胞，图示显示在进行分离前 (A) 和分离后 (B)，PE 和（未标记的） PerCP-Cyanine 5.5 的比较。分离后的数据显示，当与 PerCP-Cyanine 5.5 标记结合时，阳性 PE 荧光显著扩散，可能会影响共表达群体的检测。  

使用光谱流式细胞术解析的数据或使用常规流式细胞术补偿的数据会显示接收溢漏的检测器中阳性群体的扩散情况。分离或补偿不会导致误差或改变误差，因为光子计数误差已存在，但是将误差移动到对数刻度的低端时，误差确实更加明显。扩散可能构成问题，因为它降低了灵敏度和分辨率，并且随着配色量的增加而成为一个重要的考虑因素。发生扩散的常见原因是荧光团在相同光谱区发射，相似性较大，且荧光团极为明亮（表1）。

扩散是累积的，发射受到实验中以相同波长发射的所有荧光团导致的影响。虽然没有方法消除扩散，但最好的办法是在仪器和荧光团表征期间对扩散进行评估，设计出尽量减少扩散影响的方案。使用单染色样品，可生成扩散矩阵 [7]。这测定了在特定仪器上测量的每对荧光团的信号扩散量。扩散矩阵中的信息有助于鉴定发出或接收信号扩散的荧光团。图9 为扩散矩阵的示例，有关更多信息和交互工具，请访问光谱流式细胞术测定和试剂。

图9.扩散矩阵。仔细设计光谱流式细胞术分析的流式方案设计需要了解细胞仪的特点和荧光团特性。此由20个荧光团组成的扩散矩阵显示了荧光团的扩散水平，数据是在 3-激光 Cytek Aurora 光谱细胞仪上收集的。每行的荧光团影响该荧光团在列中的扩散。尽管矩阵中的所有荧光团都可以一起使用，但较深的红色阴影表示一种荧光团已增加了向另一荧光团的扩散，在将靶标与荧光团匹配时需要更加注意。

选择具有独特光谱特征、窄激发和窄发射特性的荧光团有助于减少扩散。建议仅对互斥群体进行高度相似的荧光团配对。扩散度高的荧光团可以与低表达标记物配对或与光谱不同的荧光团配对，以提高分辨率（图10）。在设计特定方案后，建议对该特定方案门控策略内的荧光团进行扩散矩阵评估。

图10.扩散和分辨率。使用 CD56-APC 和两种不同的 CD3 荧光团标记人淋巴细胞，以显示扩散和分辨率。(A) 使用 APC-eFluor780 标记的 CD3 导致向 CD56-APC 的显著扩散，难以分辨任何双阳性 CD3+CD56+ 细胞。(B) 换成使用 eFluor 450 标记的 CD3 可大幅度减少向 CD56-APC 的扩散，便于分辨双阳性 CD3+CD56+ 细胞。

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